le Dr Jacques M. Kalmar : Procédures biomédicales animales et non-animales en toxicologie


28 Sep 2016
Robert Linssen & Jacques Kalmar

Robert Linssen & Jacques Kalmar

(Revue Le chant de la licorne. No 10. Été 1985)

Depuis que Claude Bernard a codifié la méthode expérimentale en biologie et en physiologie, l’animal est considéré comme le « matériel expérimental », l’« instrument », le « réactif » le plus adéquat pour la recherche biologique, biomédicale, bio-industrielle, bio-militaire.

Il importe de savoir que les animaux utilisés à des fins biomédicales représentent environ 1/5 de l’ensemble, alors que les 2/5 sont utilisés dans l’industrie (chimique, pharmaceutique, cosmétique, etc…) et autant dans la recherche militaire.

En se fondant sur les statistiques américaines et britanniques, on peut estimer qu’environ dix animaux – toutes espèces réunies – meurent chaque seconde dans les laboratoires du monde entier.

En France, on utilise environ 50000 chiens, 8000 chats, des millions de souris et de rats, des centaines de primates, pour un total d’environ six millions d’animaux par an.

La toxicologie utilise environ 20 % de l’ensemble des animaux.

En présence des sévices exercés sur ces animaux un mouvement, qui s’amplifie sans cesse, est apparu dans toutes les nations industrialisées pour que les expériences pratiquées sur des animaux, ainsi que les tests, soient remplacés par des méthodes non-animales, pour employer la terminologie des anglo-saxons.

Dans cette étude nous allons considérer quatre aspects du problème :

– La fiabilité de l’animal en tant que « matériel ».

– Les tests en vigueur en toxicologie.

– Les méthodes non-animales disponibles.

– L’aspect éthique posé par les procédures animales.

1. FIABILITÉ DE L’ANIMAL

1.1. Qu’il soit élevé à des fins expérimentales, qu’il ait été volé ou abandonné ou encore enlevé de son biotope naturel, au cours des transports jusqu’à l’animalerie, où il est incarcéré dans une cage, l’animal est en état de détresse. Il a peur. Il en résulte des altérations physiologiques, variables en intensité selon son degré personnel de sensibilité.

Selon les normes européennes, l’unité d’entretien d’un chien de 15 à 20 kg sera de 1,10 m2. Celle d’un chat, de 0,30 m2. Pour une souris de 15 à 50 g, la surface de la cage sera de 200 cm2 ; pour un rat Wistar, 350 cm2.

Il est spécifié dans les réglementations que les conditions de détention doivent respecter « les besoins physiologiques et éthologiques de l’animal ». Il est même conseillé que l’animal puisse « au moins se retourner dans sa cage », comme si, ce faisant, on se hissait sur les sommets d’un humanisme fulgurant.

Pour « garantir une liberté de mouvement » des primates et « les mettre ainsi à l’abri de troubles du comportement et de lésions organiques », le biotope d’un rhésus ou d’un cercopithèque de 5 à 7 kg sera de 100 x 70 x 85 cm…

Compte tenu des conditions concentrationnaires, l’animal, dès le départ, représente un instrument déréglé.

1.2. En outre, si la recherche comporte une quantification des données, on doit considérer que les résultats obtenus varieront selon que l’expérimentation est pratiquée le matin ou l’après-midi, selon la saison, la température du laboratoire, la concentration en animaux, l’alimentation.

Dans ces conditions, si la mesure exige la précision – ce qui est un caractère assez habituel des recherches scientifiques – comment l’atteindre avec un  » matériel  » qui est déréglé avant même d’être utilisé, et qui se dérègle de multiples manières en fonction des circonstances de son utilisation et de la façon dont il est entretenu ?

Dans quelle discipline scientifique utilise-t-on un instrument d’une telle imprécision, d’une telle inconstance dans ses réponses ?

1.3. Et ce n’est pas tout. Chaque espèce a ses propres caractéristiques physiologiques, ses réactions spécifiques. De telle sorte que les résultats obtenus dans telle espèce ne seront pas très éclairantes pour une autres espèce. En particulier, les résultats des tests pratiqués sur la souris ou le rat – les plus employés parce que les plus économiques – seront difficilement transférables à l’homme. Pour le Pr M. Bertrand, de l’École vétérinaire de Lyon, « Il convient de préciser d’emblée qu’une expérience animale, si bien conduite soit-elle, ne donnera sans doute jamais une certitude en ce qui concerne l’espèce humaine ». [1]

2. LES TESTS EN VIGUEUR EN TOXICOLOGIE

Ils sont imposés par les textes nationaux et internationaux, figés et imperméables à toute nouvelle considération du problème.

2.1. La DL 50 en toxicologie aiguë.

La recherche de la dose létale 50 consiste à administrer à un animal par voie orale, percutanée ou par inhalation, une substance pour déterminer sa toxicité aiguë, dont la valeur sera exprimée par la dose en mg/kg d’animal provoquant la mort de 50 % des animaux testés dans un délai arbitrairement fixé.

Sur des animaux de la même espèce, et avec des lots de 30 animaux / dose, Trevan, en 1927 – il y a donc 58 ans – a montré que la mortalité s’exprime par une courbe de forme sigmoïde.

L’établissement d’une telle courbe exige de connaître les coordonnées d’au moins 6 à 7 points. A raison de 30 animaux par point, cela représente 180 à 210 animaux. Ce mode de recherche de la toxicité est étranger aux conditions habituelles d’emploi du produit, en particulier les doses massives utilisées pour être mortelles.

La toxicité aiguë ainsi déterminée a-t-elle une valeur réelle ou s’agit-il d’une convention commode, utilisée parce que l’on n’a rien de mieux à proposer, parce que l’on s’est refusé d’en rechercher ?

John F. Griffith, de la Proctcor and Gamble Cy a demandé à six laboratoires de tester des substances chimiques conformément à la méthode préconisée par les Federal Hazardous Substances Labeling Act Regulations (Food and Drug Administration, 1961), sur des Rats Sprague-Dowley. Le rapport entre la valeur de la DL 50 la plus élevée et la plus basse, pour chaque substance, selon les laboratoires, a été de 2 à 3. [2]

H. C. Ferguson a insisté sur l’importance de la concentration [3]. E. W. Hurst a relevé des différences de notation de la DL 50 selon le sexe de l’animal [4] et C. M. Burnett, selon la méthode de calcul [5]. M. L. Keplinger, G. E. Lanier et W. B. Deichmann ont constaté que la température de l’environnement influençait la valeur de la DL 50. [6].

En effet, L. Van Wijngaarden a obtenu une courbe de fréquence, s’apparentant à la courbe de Gauss, qui montre la distribution de la mortalité en fonction des concentrations. L’établissement de cette courbe a envoyé 326 chats dans un monde réputé meilleur, et qui n’a aucune difficulté à l’être effectivement. Fig. 2. in Valette, p. 61 [7].

Sur la courbe de Gauss, on peut distinguer trois parties. De – 3 ?, à – ?, (fraction A) cette partie concerne les personnes dont la biodisponibilité à l’intoxication par la substance testée est la plus grande avec les doses les plus faibles.

Dans la fraction B, de –? à ?, on trouve l’échantillon de population dont la biodisponibilité gravite dans les valeurs moyennes.

La fraction C, de ? à 3 ?, concerne les personnes les plus résistantes. Par conséquent, la sécurité de la fraction A est très faible ; celle de la fraction B est moyenne et celle de la fraction C est bonne.

Dans cette formulation statistique de la sécurité, il y aurait une certaine atteinte au droit de la personne et une forme de mépris et d’indifférence à l’égard de la fraction A. Les 15 à 25 % de personnes hospitalisées pour maladies iatrogènes entrent en majeure partie dans cette fraction A.

3. DÉTERMINATION CELLULAIRE DE LA TOXICITE

L’intoxication ayant un retentissement à l’échelon cellulaire, elle peut logiquement être mise en évidence par l’observation de cellules en culture ou en suspension.

L’indice de mortalité des cellules peut être déterminé par :

– le détachement des cellules de leur support.

– la coloration des cellules par altération de la perméabilité cellulaire.

– les modifications de l’indice mitotique, en évaluant l’effet d’une substance sur la croissance cellulaire :

concentration minimale mitotique, entraînant la disparition totale des mitoses (CMM).

concentration maximale inactive (CMI), n’exerçant aucune activité antimitotique.

L’écart entre CMM et CMI permet d’apprécier l’étendue de la zone d’activité antimitotique de la substance testée.

Citons également le MIT 24 Test (Mitotic Inhibition Test) [8], [9], [10], [11]; la libération des transaminases (GOT) dans des systèmes d’hépatocytes en suspension [12]; la corrélation entre la toxicité et la libération des prostaglandines (PGE et PGT) [13], [14]; le macrophage, utilisé comme modèle [15]; la détection de la toxicité par des modifications métaboliques et les altérations membranaires sur des hépatocytes en suspension [16]; l’altération des complexes jonctionnels de la membrane cellulaire (tight junction, Zonulae occludentes) [17]; test de Colin Muir sur des intestins de lapin.

Les méthodes sont nombreuses. Le problème est de les sélectionner et de les codifier. Mais, de ce problème on se préoccupe très peu, du moins en Europe. Bien que l’on reconnaisse la fiabilité très relative de l’animal comme réactif, sous l’emprise de conditionnements très profondément enracinés, on conclut toujours en affirmant que l’animal est nécessaire pour obtenir une certitude. Autrement dit, on fonde cette « certitude » sur l’emploi d’un « instrument expérimental » très incertain.

A noter que les cellules doivent être de préférence d’origine humaine, pour ne pas avoir de problème de transfert. Ces cellules peuvent provenir de tissus et d’organes ou de fragments d’organes prélevés en salles d’opération, conservés dans l’azote liquide, au lieu d’être jetés.

3.1. Infratoxicité

Observons que, pratiquement, la majorité des phénomènes toxiques concernent non des intoxications aiguës ou suraiguës, mais des microcrypto-intoxications, qui se répètent sur de très longues durées (micro-intoxications par l’alimentation, la boisson, des pollutions diverses).

Dans une première phase, de telles micro-intoxications pourront être mises en évidence, à un stade très précoce, par l’observation des altérations cellulaires qu’elles provoqueront :

– altérations de la membrane cellulaire : métaplasie, formation de configurations concentriques lamellaires, rupture de la continuité membranaire, modifications de la structure lipoprotéidique de la membrane, etc…

– altérations des mitochondries : changements de taille et de configuration, densification, etc…

– altérations du réticulum endoplasmique : indicateur très sensible des lésions cellulaires : changements de formes et de dimensions des vésicules réticulaires, « degranulation » du réticulum rugueux, fragmentation des vésicules réticulaires, etc…

– altérations du noyau : agglutination de la chromatine, disposition de la chromatine en touffes (« clumping » des auteurs anglo-saxons), etc…

Dans un deuxième temps, les micro-intoxications entrent dans une phase préclinique et dans un troisième temps la phase clinique proprement dite apparaît. Il est évident que les phases primaire (cellulaire) et secondaire (préclinique) ne peuvent guère être mises en évidence sur les animaux. Il y a donc là une voie ouverte pour l’établissement des corrélations entre les réactions cellulaires et le degré de l’intensité de l’agression.

3.2. Toxicité chronique

Il est nécessaire d’utiliser des cultures de cellules à long terme. Les cultures doivent être conduites sur des milieux nutritifs sans sérum, pour éviter l’action toxique du sérum sur les cellules. La difficulté tient au fait que vers les quinzième ou vingtième passages les cellules se « transforment » et perdent quelques-uns de leurs caractères spécifiques. Néanmoins, par suite d’une certaine « contraction du temps », qui s’opère au niveau des cultures, une telle culture d’une vingtaine de passages peut être considérée comme l’équivalent de la vie d’un rat pendant deux années environ.

3.3. Toxicité systémique

Elle concerne le retentissement toxique sur l’organisme en général. Il est admis qu’elle nécessite l’utilisation d’animaux vivants entiers. C’est d’ailleurs logique, mais les résultats concerneront ces animaux et non l’homme. On retombe toujours dans le même cycle d’objections.

Notons que l’on peut employer des co-cultures, c’est-à-dire des cultures simultanées dans la même boîte de Pétri de plusieurs tissus. La culture de base reste l’hépatocyte, puisque la dissociation des substances chimiques en leurs métabolites s’opère à leur niveau. Rappelons que ce sont ces métabolites qui pourront avoir une influence toxique ou médicamenteuse. Par conséquent, en mettant en présence les hépatocytes avec des cellules de tissu du rein, de l’estomac, etc…, on pourra observer l’action des métabolites libérés sur ces tissus.

Il est vrai que l’on ne peut pas mettre un animal entier dans une boîte de Pétri, mais il est vrai également qu’un rat entier n’est pas un homme entier.

Il importerait donc de former des ensembles de tests systématisés, en fonction de situations toxiques déterminées. En principe, il semble qu’une batterie de tests pourrait renfermer un test morphologique, un test métabolique, un test génotoxique, et un test de toxicité systémique sur co-culture.

La difficulté majeure consistera à se libérer des conditionnements et admettre que les cultures de cellules – et les modèles mathématiques en certaines circonstances – doivent être admis non en tant que « compléments », mais comme éléments de recherche toxicologique de base.

4. ASPECT ÉTHIQUE

Des méthodes substitutives sont actuellement disponibles en cosmétologie, en pharmacologie, mais il existe des domaines de la recherche où de telles méthodes ne sont pas encore disponibles.

L’éthique intervient dans le choix des méthodes et dans la limite qui doit être apportée à la recherche, en particulier celle qui ne déborde pas le cadre de la curiosité.

James Ullman, professeur de psychologie à l’université de Dallas (E.U.), au cours d’un Congrès sur « Science et conscience, les deux lectures de l’univers » (octobre 1979), déclarait ; « Nous obtenons la mesure d’un événement par précision de son contenu. Ce que j’entends ici par « précision » est le protocole d’un événement établi non seulement en termes d’exactitude mathématique, mais aussi en fonction de sa spécificité éthique et esthétique ». Ullman observe que les mots « mesure » et « juste » ont des implications éthiques et esthétiques. Il ajoute : « certains parmi ces aspects éthiques et esthétiques sont ensevelis au fond de la méthode scientifique ».

Une expérimentation sur l’animal étant en soi un événement, il en résulte que son analyse critique doit non seulement tenir compte des impératifs scientifiques, mais également des exigences éthiques et esthétiques. Pour le mathématicien Poincaré, l’esthétique en géométrie est liée à l’élégance du raisonnement et de la solution. Dans toute bio-expérimentation, l’esthétique sera déterminée par l’élégance du choix de l’instrumentation et de la procédure employées. Il est certain que dans l’expérimentation sur l’animal, l’esthétique est très relative et l’éthique peu évidente.

En définitive, si l’on tient compte de l’énorme quantité d’expériences qui ne sont que d’interminables répétitions au long des années ; de celles dont l’objet et la portée échappent, de celles qui pourraient être pratiquées par d’autres méthodes, que reste-t-il ? On considère que 10 % environ d’expérimentations ne pourraient actuellement être réalisées autrement que sur des animaux. Alors intervient la position de ceux qui estiment que la fin justifie les moyens, et la position de ceux qui affirment que l’« utilité » n’est pas un critère suffisant, car le critère décisif se définit dans ce qui est admissible et ce qui ne l’est en aucune circonstance. Dans certaines nations, la torture est considérée comme étant politiquement nécessaire, mais est-elle admissible ? Dans nos sociétés les sévices infligés à des animaux sont considérés comme scientifiquement nécessaires mais est-ce admissible ? La torture a été utilisée pour des motifs religieux. On estime maintenant que les tortures pour des raisons politiques, religieuses sont inadmissibles. Il est évident que celles qui sont actuellement pratiquées sur des animaux au nom de la Science subiront le même sort.

« La société la plus élevée est celle où les principes les plus hauts sont respectés » (Vivekananda). La violence est partout parce que le respect est parcellaire. Un jour viendra où l’on admettra que tout ce qui existe doit être respecté ou que finalement rien ne le sera.

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1 Communication présentée dans le Colloque de l’INSERM sur « Les bases scientifiques et réglementaires de l’évaluation des médicaments », 15-19 décembre 1980, Paris, Volume 96.

2 Interlaboratory variations in the determination of acute oral DL 50. The Proctcor and Gamble Company, Ivorydale Technical Center, Cincinnati, Ohio, Toxicology and Applied Pharmacology, 6, 726-730, (1964).

3 Dilution of doses and acute oral Toxicity, Toxicity and Applied Pharmacology, 4, 759-762.

4 Sexual differences in the toxicity and therapeutic action of chemical substances. A symposium on the evaluation of drug toxicity, pp. 12-25, Little Brown, Boston.

5 Variables affecting the determination of acute oral toxicity presented at the American Industrial Hygiene Conference, Cincinnati, Ohio.

6 Effects of environmental temperature on the acute toxicity of a number of compounds in rats. Toxicology and Applied Pharmacology, 1, 156-161.

7 Masson éditeur. Paris

8 B. Ekwall et R. Sandstrom, Improved use of Metabolic Inhibition Test to screen combine drugs toxicity to He La cells – preliminary study of 61 drugs pairs, Toxicol. Lett. 2, 1978, 293-298.

9 B. Ekwall et R. Sandström, Combined toxicity to He La cells of 30 drugs pairs, studied by a two-dimensional microtitre method Toxicol. Lett., 2, 1978, 285-292.

10 B. Ekwall et A. Johansson, Preliminary studies on the validity of in vitro measurement of drug toxicity using He La cells. I. Comparative in vitro toxicity of 27 drugs, Toxicol. Lett., 5, 1980, 297-305.

11 B. Ekwall, Preliminary studies on the validity of an in vitro measurement of drug toxicity using He La cells. II. Drug toxicity in the MIT 24 System compared with mouse and human lethal dosage of 52 drugs, Toxicol. Lett., 5, 1980, 309-317.

12 Ch. A. Tyson, Chozo Mitoma, y. Kalivoda, Evaluation of hepatocytes isolated by a non perfusion technique in a prescreen for cytotoxicity, J. of Toxicology and Environmental Health, 6, 1980, 197205.

13 B. Uvnäs, Mast cells and inflammation, In Inflammation biochemistry and Drug interaction, Proc. of an international symposium, Como, Italy, 11-13 October 1968, A. Bertelli (Milan) et y. C. Houck (Washington) éditeurs, Excerpta Medica Foundation Amsterdam, 1969.

14 R. Keller, Mast cells and inflammation, in id. p. 234.

15 M. Roberfroid, D. Deboyser, F. Goethals et G. Krack, Hépatocytes isolés maintenus en survie, modèle d’étude toxicologique in vitro, Premier Séminaire de Réflexion et de Concertation sur les Tests d’irritabilité et de toxicité, étude comparative des procédures animales et non-animales, Angers 1982, organisé par l’Association Scientifique Française pour une Biologie sans cruauté, coordinateur Dr J. M. Kalmar.

16 Michel Edidin, Surface topography and Tight junction integrity in Epithelial and endothelial Cell lines, John’s Hopkins Univ. Depat. of Biology, in Managing Regulatory problems in Time of Change, Alternatives to Animal Testing, IICCI Conference, Alan M. Goldberg éditeur, Paris 1982.

17 P. Padieu et M. Chessebeuf, La culture de cellules hépatiques, Méthodes de culture et expression de fonctions différenciées, Séminaire, voir (réf 15).